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来源:未知 时间:2019-10-09 05:07 浏览:

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  学士学位论文题目名称: 平菇凝集素基因lec的克隆     学生姓名:     XXX         院  系:  XXX  专业年级:XXXX指导教师:   XXXX   职  称:XXXX  X年 X月 X 日目录摘要与关键词  前言  材料与方法  实验材料  实验材料  菌株和质粒  培养基  主要试剂  PCR引物  实验方法和步骤  平菇子实体基因组DNA提取  平菇凝集素基因的PCR扩增  PCR扩增产物电泳及回收纯化目的片段  平菇凝集素基因的克隆和筛选  重组克隆pMDlec的鉴定  平菇凝集素基因的序列分析  结果与分析  平菇lec基因的克隆  重组克隆载体的构建及鉴定  测序结果及序列分析  结论  参考文献  致谢…………………………………………………………………………………………平菇凝集素基因lec的克隆摘 要:植物凝集素是来源于植物的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质。由于其对于单糖或糖复合物特异性结合的能力使得其在如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用。作为药用真菌重要的药理成分,蘑菇凝集素已成为继研究蘑菇多糖之外的另一主要活性物质。由于凝集素具有抗虫的作用为了研究蘑菇凝集素基因在提高食用菌抗虫性方面的作用本实验提取平菇子实体的DNA利用PCR技术扩增目的基因lec得到了bp的目的片段将目的片段回收后连接到克隆载体后进行测序分析利用软件对凝集素基因进行了核酸序列分析发现其开放阅读框为bp为下一步在大豆等作物中的抗虫功能验证提供了基础。关键词:平菇抗虫凝集素基因基因克隆CloningofLectinGenefromPleurotusostreatusAbstract:Plantlectinsarecarbohydratebindingproteinswithnonimmuneorigin,andtheycouldbindcarbohydratesreversibly,agglutinatecellsorprecipitatepolysaccharidesandglycoconjugatesDuetothespecificbindingactivitiestowardspolysaccharidesandglycoconjugatesofplantlectins,theyplayimportantrolesinsignalingpathways,immunoregulationandplantdefenceAsakeypharmaceuticalcompositonofmedicinalfungi,mushroomlectinhasbeenanactivesubstancewhichhasvariousbiologicalandphysiologicalactivitiesandhasbeenprofoundlyinvestigatedLectinshasinsecticidalactivity,inordertostudytheapplicationoflecgeneinimprovingtheinsecticidalactivityofediblefungus,lecgenewasclonedfromPleurotusostreatus(leurotusostreatus)DNAwasextractedfrompleurotusfruitbodies,clonedthisgenebyPCRThenthesegenewereinsertedintopMDTvectorandgenesequencingThebioinformaticsmethodswereusedtoanalyzetheaminoacidandDNAsequence,thesequenceincludedanopenreadingframeofbpKeywords:PleurotusostreatusInsecticidalLectinCloning前言平菇原专指糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)现常将侧耳属中可以栽培的种泛称为平菇。平菇在真菌分类中隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。平菇的产量在我国食用菌种类中排第一位占我国食用菌总产量的左右而且在世界上平菇的消费量也仅次于双孢菇。平菇在我国的分布广泛种质资源较为丰富且平菇中具有多种营养成分在食品及医药行业应用广泛。凝集素在蘑菇中的分布凝集素在蘑菇的子实体、菌丝、菌核、孢子等中均有分布,绝大多数蘑菇凝集素为从子实体和菌丝中提取,也有从菌核中提取的,但尚未见由孢子提取凝集素的报道。刘艳如等对种食用菌子实体凝集素进行筛选及凝集活性、抑制试验、热稳定性试验其中有种食用菌提取液能凝集两种或两种以上供试细胞表现出凝集活性。凝集素的活性不仅与真菌部位有关与发育阶段也有一定相关性。KanekoT对白黄侧耳(Pleurotuscornucopiae)子实体形成期间外源凝集素的合成进行了研究。白黄侧耳在菌丝培养阶段不含有任何外援凝集素原基期含量很少在子实体成熟期内数量增加可见凝集素的合成是随着子实体的发育而调节的。这些结果表明凝集素的合成起始于形态分化开始之际。研究证明冬菇(Flammulinavelutipe)、盘基网柄菌(Dictryosteliumdiscoidium)、(Myxococcusxanuthus)等的子实体形成过程中也伴有凝集素的合成。这些研究推测有机体的变化过程中凝集素的出现与子实体的形成有密切的关系。此外杨树菇(Agrocybeaegerita)凝集素AVVP可能是子实体形态建成过程中的关键因子之一。蘑菇凝集素的作用蘑菇凝集素具有多种生物活性,主要包括抗肿瘤活性、抗植物病毒及杀虫活性、促菌丝分化等功能。这里主要介绍下凝集素抗虫方面的作用植物凝集素在植物的防御反应中起重要作用具有抗细菌、真菌、昆虫甚至阻止被动物猎食的功能。有研究表明大型真菌凝集素在真菌体内可能与植物凝集素相似在真菌的防御反应中具有重要的作用。许多蘑菇对昆虫表现出毒性。王鸣对种蘑菇的毒性进行了研究表明蛋白质对蘑菇子实体杀虫活性起着重要作用在数种蛋白质中由于凝集素不受蛋白酶影响所以是很好的杀虫剂候选材料。VeroniqueTrigueros等人分离的红绒盖牛肝菌(XerocomusSpadiceus)凝集素对双翅昆虫、半翅类昆虫有很强的毒杀作用另外其cDNA和gDNA在大肠杆菌中表达所产生的凝集素同样具有较强的毒杀作用。作者推测可能的机理为:)该凝集素与中肠上皮细胞或围食膜基质(peritrophicmatrix)结合减少昆虫的进食量)该结合抑制上皮细胞的增殖)凝集素穿过中肠上皮细胞屏障进入昆虫的血液循环系统通过干扰昆虫本身血淋巴中的凝集素而导致中毒作用。虽然确切的机理尚不清楚但作者推测该凝集素有望通过转基因技术开发成新型的生物农药。NaotoIijima对两种编码白黄侧耳(Pleurotuscornucopiae)子实体凝集素的基因基因序列进行分析数据表明两种编码白黄侧耳(Pleurotuscornucopiae)子实体凝集素的基因和捕食线虫真菌凝集素基因序列相似。BleulerMartínezS报道了一种凝集素介导的高等真菌捕食者抵抗寄生物的。有的学者对香菇子实体凝集素的生理活成分和毒性进行了研究。因此本论文将对调控平菇凝集素抗病虫功能的凝集素基因lec进行克隆并构建克隆载体一方面为深入探索平菇凝集素抗病虫的分子机制奠定基础另一方面为利用基因工程手段培育抗虫作物和食用菌新品种提供候选基因。材料与方法实验材料实验材料平菇(Pleurotusostreatus)品种“沈平”由吉林农业大学菌物中心提供。菌株和质粒大肠杆菌(Escherichiacoli,Ecoli)DHα由本实验室保存克隆载体pMDTvector购自TaKaRa公司。继续阅读

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